ELISA標準操作及假陽性產生的原因分析

.本底及假陽性產生的原因分析

1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區別

1.1 基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或

酵母菌為表達系統。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：

a． 分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到

數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。

b． 穩定性好。包被的抗原的穩定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被

抗原的試劑盒效期只有 3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。

c． 基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產物包含更多的抗原決定

簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。

d． 純化難度大。基因工程抗原的純化技術難度較大。

1.2 合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片

段。合成肽抗原有以下特點：

a． 分子量太小

b． 一般只含有一個抗原決定簇

c． 純度高

d． 穩定性差

由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的*性，ELISA 診斷試劑經歷了從合

成肽向基因工程抗原的過渡。就 HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產品為合成肽抗原，主要

是 HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，

只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了 HCV 的核心區片段；第三代產品基本上采用了基

因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩定、純度更高的 HCV 特異性抗原。第三代試劑

的敏感度大大提高了。

由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量 ELISA 反應試劑盒，因此有些廠

家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏

感度不夠，穩定性也成問題。值得欣慰的是也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學

得對待反應結果。

2．假陽性本底產生的原因

2. 1 抗原因素

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2.1. 1 融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基

因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿

菌的因子發生反應而產生了可疑標本。

2.1.2 錯誤排序的影響。合成肽在制備過程中，如果某些肽序列錯誤，會導致合成肽特異性

改變而產生假陽性。另外，在構建基因工程表達載體時引入的 HCV 核苷酸發生相位改變或

點突變也會對抗原的特異性產生不利的影響，但由于基因工程技術的不斷進步，由工藝原因

造成的抗原特異性降低會逐漸被克服。

2.2. 3 抗原純度對特異性的影響。以 HCV 抗原為例，利用大腸桿菌大規模表達后需經破碎

細胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能后的到一定純度的 HCV 抗原。目前的

工藝還不能做到抗原純度為 100％，因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過大

腸桿菌感染的人，血清中的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產生反應而引起假陽性。

2.2 人血清中的正常 IgG 

 人血清中 IgG 的濃度對 HCV 試劑盒有較大的影響。HCV 試劑盒采用的間接法，酶標抗

抗體能與人所有 IgG 結合，而 IgG 吸附于板孔的能力很強，因此我們采用 100 微升樣稀加

10 微升血清來將其稀釋以降低本底。到成人時，據統計學調查，成人的 IgG 為 12mg/ml，

而有些人的 IgG 濃度會遠遠高于此，這部分人的血清經 ELISA 反應后往往會顯色。

2.3 人血情中異常的 IgG 

結締組織病（系統性紅斑狼瘡、多發性骨髓瘤等）等病癥時，血清中的風濕小體和其它

異常 IgG（IgG 濃度達到 50mg/ml）會引起本底升高或假陽性。

2.4 溶血的影響

 當溶血時，紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質，當其通

過吸附或“PP 效應"（蛋白質間相互吸附的現象）結合后，可催化 A、B 液顯色而造成假陽

性。

2.5 操作不當引起

 任何操作不當都會影響結果，因此在操作過程中保證操作的規范，嚴格按照說明書進行是

得到準確結果的關鍵核基礎。

2.5.1 加樣

2.5.1.1 樣品稀釋液少加，或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個

因素影響更大。因為血清中受檢的特異性 IgG 只占總 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很強，

非特異 IgG 可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的 IgG

均可以和酶標二抗發生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規定

的稀釋倍數，必將帶來陰性高值。

2.5.1.2 酶結合物的不正確加入。一般來講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯板

再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為 120μl。如果加入的

酶多于 120μl 或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。

2.5.2 溫育

5.2.1 由于試劑盒確定的一定溫度下的反應時間并不是反應的終點，升高反應的溫度，會

加快反應，同樣增加時間會延長反應，這樣得到的反應程度會比試劑盒確定的反應程度多，

也會引起陰性高值或假陽性。

5.2.2 由于試劑盒通常設定的反應溫度為 37 度，在這個溫度下放置 30 分鐘，蒸發的水分

會很多，對于整個反應體系來講，各種反應物的濃度會不斷增加，這樣必會導致反應后的

值升高。因此溫育時應蓋上膠貼。

5.2.3 試劑盒在設計時，反應是在靜置條件下完成的，如果反應改變為振動條件，會加快

分子的熱運動，增加反應的機會。

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5.2.4 試劑盒的溫育過程是在培養箱中進行，這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯板迅

速升溫，但較難將溫度控制在較穩定的溫度，往往高于 37 度，同樣會引起高值陰性。

2.5.3.洗板

2.5.3.1 各個廠家使用的洗液配方是不同的，是根據各自試劑的條件配制的，采用不配套的

洗液常會得到不正常的反應結果，包括本底過高。本公司的洗液采用獨特的洗滌系統不能和

其它公司的試劑盒混用。

2.5.3.2 試劑盒中提供的洗液是濃縮的，應該稀釋到規定的倍數使用，過多稀釋洗液，會影

響洗液的效果，而使反應的本底過高。

2.5.3.3稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水，電導率小于1.2μs。如果水中含有過多的Ca2+、

Mg2+，這些離子會占用表面活性劑，影響洗滌效果。

2.5.3.4 洗板時，應每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對洗滌的效果影響也是很大

的。本公司的酶聯板板孔為 400μl，比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時

調整液量，以避免加液量不滿。

2.5.3.5 洗板的次數不夠孔內多余的抗原（抗體）或酶結合物不能*去除，也會因此本底

升高。

2.5.3.6 洗板的強度和洗板的浸泡時間是密切相關的。洗板機不同，使用的泵不同，液體加

入時的沖力不同。如果加入洗液的沖力不大，也沒有設定浸泡時間，同樣會使結果的 A 值

偏高。

2.5.3.7 洗板完畢后，要進行拍板，盡量采用質量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，

紙屑會留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。

2.5.4 顯色。加 A、B 液準確，順序不能顛倒，要及時終止顯色。終止后要在 3 分鐘內讀

數，否則強陽性會變低。

2.5.5.槍頭、加樣槽或其它來源的污染

如果使用的槍頭、加樣槽是反復使用的，必須肯定其沒有來自酶或陽性的污染。酶作為反應

的催化劑，及其微量也會很明顯影響反應。反復使用的槍頭、加樣槽清洗不當，也會干擾反

應。如將槍頭使用 84 消毒液浸泡而沒有沖洗干凈，因為 84 是強氧化劑，加入 AB 液后就會

顯色。同樣槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的 PH 值，反應的結果也會不正常。常

常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會將紙上的強氧化劑留在槽中

而影響反應。

2.5.6.測 A 值時，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規則的表面都可能引起 A 值的

升高。